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Gamma-H2AX 焦点形成免疫荧光检测
2018-05-16 22:19

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  Gamma-H2AX 核心构成免疫荧光检测_生物学_天然科学_专业材料。尝试步调 1. 各组细胞别离处置后,弃培育基,PBS 洗涤三次(打到壁上) 。 2. 多聚甲醛固定 20min,4°C (4%多聚甲醛)。 3. 弃多聚甲醛,PBS 洗涤三次,0.2%-5% (5%浓

  尝试步调 1. 各组细胞别离处置后,弃培育基,PBS 洗涤三次(打到壁上) 。 2. 多聚甲醛固定 20min,4°C (4%多聚甲醛)。 3. 弃多聚甲醛,PBS 洗涤三次,0.2%-5% (5%浓度太大,不易消融,2%) Triton-x (笼盖爬 片即可) ,破膜 15min 4. 弃 5% Triton-x, PBS 洗涤三次,5%BSA 工作液,室温封锁 2h。 5. Gamma-H2AX 抗体(1:200) (10μl)孵育细胞,4°C 留宿。在缠了封口膜的载玻片上孵 育,载玻片-封口膜-抗体-细胞-爬片(有细胞那面的朝下) ,孵一抗二抗都要将载玻片置 于孵育盒内,盒底铺纱布,PBS 潮湿。 6. PBS 振荡洗涤 3 次,每次 5min,FITC 标识表记标帜羊抗鼠二抗(1:1000) 。室温孵育细胞 2h (在 暗室操作) 。 7. PBS 振荡洗涤 3 次,每次 5min,DAPI 室温染色 10min,PBS 洗涤 3 次。 8. 滴加抗荧光猝灭剂封片剂,指甲油封片,Niko 共聚焦显微镜下察看(避光) 。 溶液配制:现配现用(需预备大量 PBS) 4%多聚甲醛 5%BSA 工作液,取 1g 或 2g BSA,于 PBS 20ml 或 40ml 5% Triton-x 100:取 1ml Triton-x100,加 PBS 至 20ml,4°c 保留备用。 2% Triton-x100: 1ml Triton-x100 溶于 50ml PBS 细胞传至 3 代预备处置时间接将细胞接种至放有爬片的 24 孔板,接种密度,2 皿-2ml-1/20 爬片在孔板底部不易取出,需用针头挑出 为使针头挑爬片更容易,可将爬片置于直径较大的六孔板中

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